1.4 仪器
Sorvall ST 8R型高速冷冻离心机、UltiMate 3000型超高效液相色谱仪、Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪、DAD检测器、Xcalibur质谱工作站（美国Thermo Fisher Scientific公司）；BSA2202S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-2A型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；1-15PK型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；CM-12型水浴氮吹仪（北京成萌伟业科技有限公司）；BT-100-1F型蠕动泵、LSP02-1B型注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）。
2 方法
2.1溶液的制备
称取200.20 g栀子粉末，加入10倍量50%乙醇，超声（40 kHz、200 W）提取20 min，纱布滤过，滤渣按上述条件再次提取。合并2次提取液，取上清液用50%乙醇稀释2倍后，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液进行液质分析。提取液于50 ℃水浴蒸至稠膏状约100 mL，双层纱布滤过，用0.5%羧甲基纤维素钠复溶混悬制成生药量为1 g/mL的栀子提取物混悬液200 mL，于4 ℃储存，作为灌胃液和灌流液备用。
2.2肠代谢研究
2.2.1 肠壁代谢组采用在体肠道灌流并行采血法实验操作：随机选取5只禁食12 h（不禁水）的大鼠，4只为供血组，1只为实验组。麻醉大鼠，供血组腹主动脉采血后置于肝素钠离心管，并于37 ℃水浴加热，用于补充手术过程中损失的血液。实验组大鼠首先剥离颈静脉，插入静脉留置针后滴加医用胶黏合，将另一端连接到盛有供血的离心管中。沿腹中线剪开腹腔，选择十二指肠以下约10 cm的空肠作为供试肠段，用5 mL注射器抽取37 ℃生理盐水缓慢冲出肠内容物，至流出液澄清，继续充入空气将生理盐水排净。在供试肠段首尾处各剪一小口并插入玻璃管引流液体，将栀子提取液（1 g/mL）注入肠段，末端开口排出，通过注射泵控制体积流量为0.2 mL/min。结扎肝门静脉，在肠系膜静脉插入充满肝素钠的静脉留滞针，结扎周围多余血管，另一端通过蠕动泵收集血液至干净离心管。将纱布用37 ℃生理盐水润湿后覆盖在裸露肠段上，保温灯加热保持大鼠体温稳定。开启蠕动泵，进行颈静脉输血（体积流量0.3 mL/min），肠系膜静脉采血，连续采血2 h后，处死大鼠。
2.2.2 肠道菌群代谢组大鼠麻醉后选择盲肠以下约8 cm的结肠肠段作为供试肠段，将栀子提取液注入肠腔，当药液到达肠段末端，用手术线结扎末端，取下注射器并结扎肠段前端。其余操作同肠壁代谢组。采血2 h处死大鼠。平行实验3组，空白组注射泵给予生理盐水，其余操作相同。
2.3肝代谢研究
肝代谢研究与肠代谢研究在手术操作上的不同在于是否结扎肝门静脉以及采血点位置。肝代谢研究中不结扎肝门静脉，并于股静脉处采血，其他操作同“2.2”项下的肠代谢研究。
2.4综合代谢研究
选取3只SD雄性大鼠，ig 4 mL栀子提取液（1 g/mL），2次/d，持续3 d，末次给药2 h后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，于4 ℃储存，进行后续处理及分析。空白组ig生理盐水，其余操作相同。
2.5血液样品处理
分别将收集的肠代谢、肝代谢、综合代谢组血液进行合并后，4 ℃、4000 r/min离心10 min，分离得到血浆后，加入等体积的冰乙腈混合沉淀蛋白，涡旋2 min，4 ℃、8000 r/min离心10 min，取上清液进行氮吹，吹至100 µL，用50%甲醇300 µL复溶后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液，供UPLC-HRMS分析。
2.6色谱条件
Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～1 min，10% A；1～4 min，10%～15% A；4～18 min，15%～30% A；18～24 min，30%～50% A；24～28 min，50%～100% A；28～31 min，100% A；31～32 min，100%～10% A；32～35 min，10% A；柱温30 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样体积5 µL。
2.7质谱条件
采用加热电喷雾离子化源（HESI），喷雾电压分别为3.5 kV（HESI+）和3.0 kV（HESI−）；HESI温度为400 ℃；毛细管加热温度为320 ℃；鞘气和辅助气均为氮气，纯度＞99%，碰撞气为高纯氮气，纯度＞99.99%；鞘气压力241.325 kPa；辅助气压力68.95 kPa；正离子和负离子模式同时采集，扫描范围m/z 100～1500；碰撞能量（NCE）为20%、40%、60%；质谱分辨率70 000。
3结果
3.1 栀子提取液中化学成分鉴定
根据“2.6”“2.7”项下条件对栀子提取物中的化学成分进行分析，栀子提取液的总离子流图见图1。将供试品与对照品的保留时间（tR）、准分子离子峰、二级碎片和裂解规律进行比对，确定了其中的6个化学成分。基于文献调研并综合对照品信息，建立含栀子化学成分名称、分子式以及相对出峰顺序等信息的数据库，并借助Xcalibur 4.0软件对总离子流图上的峰进行精确相对分子质量识别，共鉴定出46种化合物（表1），主要为环烯醚萜苷类、有机酸及其衍生物类、单萜类、黄酮类化合物。
3.1.1环烯醚萜苷类化合物鉴定从栀子提取液中共鉴别出栀子苷、栀子新苷和山栀苷等23个环烯醚萜苷类化合物。下面以栀子苷和山栀苷为例进行质谱解析。
化合物17准分子离子为m/z 387.129 4 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C17H24O10，tR为4.87 min（误差为0.693×10−6），二级碎片离子为m/z 225.077 4 [M－H－C6H10O5]−、m/z207.066 8 [M－H－C6H10O5－H2O]−，分别为失去1分子葡萄糖基、继而失去1分子H2O的碎片离子，此外还产生m /z123.045 4、101.024 6碎片离子。通过与文献数据[21,25]比对及与对照品出峰时间比较，推测其为栀子苷。
化合物7的tR为3.13 min，准分子离子为m/z391.124 5 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C16H24O11（误差为1.221×10−6），二级碎片离子有m/z229.071 7 [M－H－C6H10O5]−、m/z211.060 9 [M－H－C6H10O5－H2O]−、m/z185.081 3 [M－H－C6H10O5－CO2]−、m/z167.071 1 [M－H－C6H10O5－H2O－CO2]−，分别为失去１分子葡萄糖基，继而失去1分子H2O或1分子CO2、再失去1分子H2O或1分子CO2的碎片离子。与文献数据[21,23-24]对比，推测其为山栀苷，其裂解途径见图2。
3.1.2有机酸及其衍生物类化合物鉴定从栀子提取液中共鉴定出绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸等8个有机酸及其衍生物类化合物。下面以绿原酸为例进行质谱解析。化合物19准分子离子为m/z353.087 4 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C16H18O9，tR为5.49 min（误差为0.405×10−6），二级碎片离子为m/z 191.056 6 [M－H－C9H7O3]−、m/z 179.056 8 [M－H－C7H11O5]−，分别为失去1分子咖啡酰氧基基团或奎尼酸基团形成的碎片离子，此外还产生m/z 173.045 9、135.062 5碎片离子，进一步验证化合物19是绿原酸类成分。文献报道了绿原酸的二级质谱裂解规律，m/z 191.056 6碎片响应最强，m/z179.065 8和m/z 135.062 5强度都较弱。本实验与报道的现象相似，推测化合物19可能为绿原酸，裂解规律见图3。
3.1.3黄酮类化合物鉴定从栀子提取液中共鉴定出芦丁、异槲皮苷等4个黄酮类化合物。下面以芦丁和异槲皮苷为例进行质谱解析。化合物30准分子离子为m/z609.146 3 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C27H30O16，tR为10.79 min（误差为1.216×10−6），二级碎片离子为m/z301.035 9 [M－H－Rha]−、271.025 5 [M－H－Rha－CH2O]−，为失去1分子芸香糖基、继而丢失碳环羰基形成，表明该化合物可能为黄酮类，其苷元为槲皮素，与文献数据[21]对比，推测其为芦丁，裂解途径见图4。
化合物31准分子离子为465.101 8 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C21H20O12，tR为11.60 min（误差为9.38×10−7），二级碎片离子为m/z301.035 0 [M－H－C6H10O5]−、271.025 5 [M－H－C6H10O5－H2O]−、255.028 1 [M－H－H2O－CH2O]−，为失去1分子葡萄糖、继而丢失1分子H2O形成，m/z 255.028 1为槲皮素碎片丢失A环上1分子H2O后，进一步丢失碳环羰基形成的碎片，与芦丁的二级碎片信息相似，具有和芦丁相同的母核，结合文献数据[21,25]推测其为异槲皮苷。
3.1.4萜类化合物鉴定从栀子提取液中共鉴定出10个萜类化合物，包括8个单萜类成分和2个二萜色素类成分。下面以西红花苷I和jasminoside B为例进行质谱解析。化合物37准分子离子为m/z975.371 0 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C44H64O24，tR为13.34 min（误差为0.044×10−6），二级碎片离子为m/z 651.267 4 [M－H－2C6H10O5]−、327.160 9 [M－H－2C6H10O5－2C6H10O5]−，为失去一端的2分子糖基，继而脱掉另一端的2个糖基形成，与文献数据[21]对比，推测其为西红花苷I，裂解途径见图5。栀子二萜色素类成分的裂解方式主要是糖苷键的断裂，丢掉葡萄糖基团，再丢失CO2中性分子。化合物18准分子离子为m/z345.155 2 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C16H26O8，tR为5.34 min（误差为7.75×10−7），二级碎片离子为301.042 5 [M－H－CO2]−，165.092 1 [M－H－C6H11O6]−，分别为失去1分子CO2及1分子葡萄糖基形成，与文献数据[21,24,27]对比，推测其为jasminoside B。
3.1.5其他类别化合物鉴定从栀子提取液中还鉴
定出1个酚类化合物。化合物14准分子离子为m/z 327.144 7 [M－H]−，Qualbrowser软件给出的精确分子式为C16H24O7，tR为3.96 min（误差为8.32×10−7），二级碎片离子为m/z165.092 3。与文献数据[23]对比，推测其为zataroside B。
3.2 原型入血成分鉴定
通过对比不同处理组血浆及空白血浆，对肠代谢、肝代谢及综合代谢组血浆样品中原型入血成分进行统计，在各血浆样品中共检测到38个栀子原型入血成分，大多数为栀子苷、栀子新苷、山栀苷等环烯醚萜苷类成分。结合表2，在肠代谢中，肠壁代谢组和肠道菌群代谢组在原型入血成分上无差异，表明它们在胃内稳定并可以通过肠壁吸收入血。Yu等[29]采用肠灌注模型发现，栀子苷在整段小肠内均有吸收，其中十二指肠吸收速率最大，吸收机制除被动扩散外，还有主动转运和易化扩散。1、3、7～14、16、17、21、23这14种成分在4种血浆样品均可以检测到，说明以上成分不仅在胃内稳定，且无肠壁代谢、肝代谢，推测因小肠内吸收快，无大肠内的肠道菌群代谢，故原型成分在体循环稳定。25～29、32～36、38、44、45这13种成分在肠代谢中可以检测到，但并未在肝代谢及综合代谢中检测到，推测这些化合物可能经过胃肠道吸收入血，可分布在肝脏中并经由肝药酶代谢。现有研究表明，肝脏内代谢酶细胞色素酶P450家族3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）、硫酸基转移酶2A1（sulfotransferases 2A1，SULT2A1）和尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1）协同介导了京尼平于肝脏的代谢解毒，且CYP3A4是起决定因素的限速酶[30]。5、6、15、19、20、22、24、38～42这12种成分在肠代谢、肝代谢组血浆样品中均可检测到，但在综合代谢样品中未检测到，推测原因可能是在胃内进行了代谢。实验结果表明，环烯醚萜苷类、有机酸类、酚类等成分均能以原型吸收入血，原型入血成分多达38个，而综合代谢组血浆样品的原型入血成分仅有14个，推测一方面由于综合代谢采用ig给药，定点采血，部分成分因吸收慢尚未进入血液，或成分吸收、代谢、排泄快，以代谢产物形式存在于血液循环中或排出体外，导致血液中未检测到原型入血成分，另一方面胃液中的酸性环境也会使部分化合物发生水解。此外，由于结肠部分含有丰富的肠道菌群，推测化合物可能受到肠道菌群的影响而代谢转化。
3.3代谢产物鉴定
在肠代谢中，肠壁代谢组和肠道菌群代谢组血浆样品中鉴定出22个相同的代谢产物，包括山栀苷脱羧产物、栀子苷硫酸盐结合物、山栀苷甲酯氢化产物等，详细信息见表3，2组代谢产物基本无差异。大多数药物在进入全身血液前都会经历肝代谢，通过比较肝代谢血浆样品和空白血浆样品，在肝代谢组中共鉴定出16个代谢产物，成分8、11、13、14、15、17在肝代谢样品中消失，推测其在肝内进行了进一步代谢。综合代谢组中鉴定出14个代谢产物，主要包括栀子新苷水解产物、山栀苷甲酯去葡萄糖产物、绿原酸谷氨酰胺结合物等，详细信息见表3。除绿原酸、槲皮素等的代谢成分外，主要代谢成分通过栀子苷、栀子新苷等环烯醚萜苷类代谢产生。以栀子苷、栀子新苷为代表的栀子环烯醚萜苷类成分主要代谢途径包括氧化、水解、脱羧、葡萄糖醛酸化、结合硫酸盐、谷氨酸、甘氨酸等，栀子中主要环烯醚萜苷类成分代谢途径见图6。
4 讨论
中医药高质量发展的关键核心是建立科学合理的中药质量评价体系和高质量的评价标准，只有不断创新和完善中药质量评价模式，才能实现对中医药产业的正向引导，保证中药使用的安全有效[33]。2022年发布的“十四五中医药发展规划”突出了提升中药质控水平是中药研究的主要任务之一[34]。中药具有多成分、多靶点、多通路的协同调控作用，然而并非所有成分均可发挥药效，只有到达靶标并维持起效血药浓度的成分才会产生治疗作用。因此，通过鉴定入血成分及代谢产物，研究中药的代谢情况对药效物质基础的阐明和中药质量标准的提升具有重要意义。本研究将序贯代谢法和UPLC-HRMS相结合，采用在体动物实验技术，分析了栀子醇提取液和栀子肠代谢、肝代谢以及综合代谢3种不同处理组的含药血浆样品。3者的区别在于：肠代谢于空肠或结肠部位给药，于肠系膜静脉处取血，同时结扎肝门静脉及旁支血管，故此时所收集的血浆样品主要经过肠壁酶或肠道菌群代谢；肝代谢组则不结扎肝门静脉，故药物经过肠道代谢后还会经过肝脏代谢；综合代谢除了经历以上2种代谢方式外，还会经过胃液代谢，是最接近传统煎煮后口服给药的方式。结合文献与对照品比对，结果显示，从栀子醇提取液中鉴定出46个化学成分，血浆样品中共鉴定出38个结构明确且以原型入血的成分及22个代谢产物。鉴定体内代谢物主要为栀子苷、栀子新苷等环烯醚萜苷类经氧化、水解、脱羧、葡萄糖醛酸化等反应生成，这与《中国药典》2020年版一部[1]中栀子药材以栀子苷作为含量测定指标成分相符，表明以栀子苷为代表的环烯醚萜苷类成分是进入体内的主要成分，也可能是临床发挥药效的潜在活性成分。已有文献报道，上述入血成分中栀子苷、京尼平苷酸、绿原酸、6′-O-trans-sinapoyl jasminoside C等成分具有抗炎、保肝利胆、促进胰腺分泌、降血糖等药理作用[35]。如栀子苷可通过降低炎症细胞因子水平发挥抗感染及免疫调节作用，通过升高白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平，降低IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α水平，抑制炎症和氧化应激，并促进组织修复和再生，发挥肝脏保护作用[36]。
针对中药及其复方成分复杂多样的特点[37-38]，序贯代谢方法能够明确各成分在多成分环境下的代谢变化，从而缩小发现活性成分的范围，减少体外活性成分研究的盲目性和片面性，实现对入血成分的系统、全面表征。是研究药物体内吸收代谢情况的强有力技术手段[20]。综上，本研究解析了栀子化学成分在大鼠体内的代谢情况和代谢部位的成分差异，为研究栀子药效物质基础提供了科学的数据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：刘慧宁，刘 磊，于 爽，李雪岩，王新宇，祁东盈，潘福璐，柴晓钰，王倩倩，潘艳丽，刘 洋． 基于UPLC-HRMS的大鼠体内栀子多成分序贯代谢研究 [J]. 中草药, 2023, 54(18):5980-5992.返回搜狐，查看更多